Também são degradados por beta-oxidação, mas enzimas adicionais são requeridas, pois após alguns ciclos de beta-oxidação, forma-se um Δ³-cis-acil-CoA graxo (Δ³-cis-R-CoA), que não é um substrato para a acil-CoA desidrogenase. Este passo é transposto pela isomerização da dupla ligação pela enoil-CoA isomerase a Δ²-trans-R-CoA, reestabelecendo a rota normal de beta-oxidação. A enzima também é ativa para Δ³-trans, e atua em cadeias de 6 a 16 carbonos. Como não há necessidade da ação da acil-CoA desidrogenase (a molécula já contém a dupla ligação, necessitando apenas ser transformada no isômero correto, o que ocorre sem liberação de hidrogênio), a produção energética é menor, pois não há produção de FADH₂, que geraria, através da cadeia transportadora de elétrons, 2 ATPs. 

No caso de poliinsaturados, há a necessidade de outra enzima adicional, a 2,4-dienol-CoA redutase, que converte Δ²-trans,Δ⁴-cis-R-CoA em Δ³-trans-R-CoA (num passo dependente de NADPH), no qual atuará a enoil-CoA isomerase como descrito anteriormente. Neste caso, além da não formação de 1 FADH2 para cada insaturação, a segunda dupla exige gasto de um NADPH.