A oxidação se dá no carbono beta dos ácidos graxos (daí o nome), em várias etapas, cada uma produzindo um acetil-CoA e um acil-CoA graxo com dois carbonos a menos.

Os carbonos dos ácidos graxos, quando oxidados, fornecem mais ATP do que os de qualquer outra biomolécula. Para exemplificar, podemos fazer uma comparação entre o balanço apresentado acima e a oxidação da glicose.

Para fazer a equivalência do número de carbonos, devemos comparar o palmitato com 2 2/3 moléculas de glicose, o que daria um total de apenas 96 ATPs. A razão para a quantidade adicional de energia a partir dos ácidos graxos é seu maior estado de redução.

A beta-oxidação também ocorre nos peroxissomos

As reações são as mesmas que ocorrem na mitocôndria, com exceção do passo inicial de desidrogenação, que é catalizado pela acil-CoA oxidase.

Mas esta enzima é inativa para hexanoil e butiril-CoA, portanto, os peroxissomos não podem degradar completamente os ácidos graxos, sendo estes resíduos conduzidos até a mitocôndria.

Glioxissomos – são peroxissomos que também contém enzimas do ciclo do glioxalato. Em sementes em germinação, possuem as mesmas enzimas dos peroxissomos descritos.

Oxidação através do grupo metil

Uma via de menor importância para a oxidação de ácidos graxos tem sido observada nos microssomos em fígado de ratos. Esta via envolve a oxidação do metil terminal, chamado carbono ômega, ou do carbono metileno adjacente dos ácidos graxos por NADPH e oxigênio molecular. As enzimas não estão caracterizadas e, embora pareça de menor importância, esta via pode ser importante no caso de cadeias de 6 a 10 carbonos.